大家好，今天给各位分享通络清脑注射粉对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及其对神经元自噬相关蛋白表达的影响研究的一些知识，其中也会对进行解释，文章篇幅可能偏长，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在就马上开始吧！
中医辨证论认为，“中风”（缺血性中风）多见于气虚血瘀型、毒伤脑络型。伤脑络中毒型，以清热解毒、通络疗法为主。笔者课题组初步研究证实通络清脑散注射液治疗大鼠脑缺血有良好疗效，提示清热解毒通络疗法即使只辨病不辨证也能取得良好疗效；鉴于细胞自动吞噬作用引起的神经元凋亡是脑缺血后神经损伤的重要组成部分。因此推测通络清脑注射液的脑保护作用机制很可能与抑制自噬有关。
本研究的创新点和价值：
本研究以神经元自噬为切入点，分析通络清脑注射粉对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用及其对神经元自噬相关蛋白表达的影响。研究发现它具有大脑保护作用。其机制可能与抑制神经元过度自噬有关。这不仅为临床治疗缺血性中风提供了新的理论依据和可行思路，也在一定程度上丰富了中医治疗缺血性中风的科学。内涵。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本实验于2019年1月至2020年3月进行，选取SPF级、体重200~220 g的成年雄性SD大鼠36只，均由维通利华（北京）实验动物技术有限公司提供。动物证书编号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药品和试剂
通络清脑注射粉(生产企业：河北神威制药，生产批号：111100，规格：375mg/管)；抗Beclin1抗体(Ab210498)购自美国ABCAM公司；抗自噬微管相关蛋白1 轻链3A/3B (LC3A/LC3B) 抗体(12741S)、抗磷酸化核因子-B (p-NF-B) 抗体(3033S) 和抗核因子-B ( NF-B)抗体(8242S)购自美国CST公司；抗-肌动蛋白抗体（AF7012）、电泳缓冲液（HX1896）、转移液（HX1895）、羊抗兔二抗（HX2040）、羊抗鼠二抗（HX2032）、蛋白酶抑制剂（HX1863）、蛋白磷酸酶抑制剂（HX1864）、强力放射免疫沉淀（RIPA）裂解缓冲液（HX1862）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）非还原蛋白上样缓冲液（HXN1891）、牛血清白蛋白（Albumin Bovine V）（HX3304）购自华星牛基因科技有限公司；预染蛋白（Thermo26620）、电化学发光（ECL）超灵敏发光溶液（Thermo34095）购自美国Thermo Fisher Scientific。
1.3 仪器设备
奥豪斯AR2130电子天平，灵敏度：1mg；尼龙线（2432-A1）（北京西农科技有限公司）； Synergy 4型酶标仪；多媒体彩色病理图形分析系统（MPIAS-500）； IEC低温冷冻离心机（美国Thermo公司）；电子显微镜H-7500(日本日立电器有限公司)；转移电泳槽（Mini Trans-Blot Transfer Cell，BIO-RAD公司）；立式板电泳槽（Mini-PROTEAN3 cell，BIO-RAD公司）； DYY-10电泳仪（北京六仪仪器厂）； TS-1脱色摇床(江苏海门市麒麟医疗器械厂)； Bio-Rad凝胶成像仪（BIO-RAD公司）； Bio-Rad Image LabTM XRS+凝胶图像分析和管理系统（BIO-RAD公司）； Image J 图像分析软件（美国国立卫生研究院）。
1.4 动物分组及建模方法
将36只SD大鼠编号后，采用随机数字表法分为假手术组、模型组和通络清脑组，每组12只。采用缝线栓塞法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型（假手术组大鼠仅进行血管隔离，不进行其他操作）：（1）腹腔注射4.0%水合氯醛（100 mg/kg）麻醉，麻醉满意后，将大鼠置于仰卧位，固定在恒温电热毯上。温度保持在37左右； (2)将右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分开，用丝线打活结。结扎颈外动脉和颈总动脉暂时阻断，并用动脉钳夹住颈内动脉远端； (3)在颈外动脉上做一个“V”形切口，插入直径约为0.24毫米的一端，这是一个光滑的球形尼龙丝塞，直至有明显的阻力（表明尼龙丝塞已达到大脑中动脉的起点）。一般插入深度为（20.00.5）mm，可引起大鼠大脑中动脉闭塞性缺血； (4)用0.9氯化钠溶液将通络清脑注射粉配制成浓度为18.75mg/ml的溶液。通络清脑组大鼠经尾静脉缓慢注射通络清脑液3.2ml。 /kg，假手术组和模型组大鼠经尾静脉缓慢注射等体积0.9%氯化钠溶液； (5)1.5小时后，轻轻向外拉动尼龙线塞，出现轻微阻力时停止拉动，实现再灌注。
1.5 观察指标1.5.1 神经功能评分
采用单盲法和ZeaLonga评分标准对三组大鼠造模后24小时神经功能进行评价：无神经损伤症状为0分；脑缺血对侧前肢不能完全伸展，1分；转向脑缺血对侧1分。行为评分为2分；行走、向脑缺血对侧倾斜记为3分；不能自主行走且处于昏迷状态记为4分。剔除神经功能评分为0、4分的大鼠（不包括假手术组）及死亡大鼠，选择同批次购买的体重相近的大鼠补充后续实验中的实验动物数量，维持实验中的大鼠数量。每组12点。
1.5.2 脑梗塞体积比例
完成ZeaLonga评分后，每组选出4只大鼠。麻醉后，从腹主动脉采集血液。安乐死后，将大脑断头，用0.9%氯化钠溶液冲洗大脑，除去表面血迹，置于冰上，取平均值。脑片切成5片；将脑切片置于2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）染料中染色，37避光孵育15分钟，然后用磷酸盐缓冲溶液（PBS）终止孵育；染色后的脑切片（TTC可与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应，将非缺血区染成玫瑰红色，而缺血区呈苍白），置于4%甲醛溶液中固定，拍照采用多媒体彩色病理图形分析系统进行记录，采用Image J图像分析软件进行分析，计算出脑梗死体积比例。
1.5.3 海马神经元损伤
再灌注24 h后，每组选取4只大鼠，HE染色观察海马神经元损伤情况。 HE染色方法：腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠。安乐死后，通过断头取出大脑并置于固定剂中24小时以使细胞蛋白质变性。固定后，对脑组织进行修整，将修整后的脑组织放入包埋盒中，先用蒸馏水冲洗，除去脑组织中的固定液，然后脱水、透明、石蜡包埋，依次切片；切片首先用二甲苯脱蜡，然后用梯度浓度乙醇复溶。用水和蒸馏水冲洗，并用苏木精染色15分钟；用自来水洗去切片上的苏木精染色，用1%盐酸乙醇分化15秒，自来水浸泡10分钟。然后取出切片并将其置于伊红染色中。染色3 min，然后用蒸馏水冲洗3 s，并在梯度浓度乙醇中脱水，最后用二甲苯透明中性胶密封。
1.5.4 海马和皮质自噬体的形成及海马神经元自噬相关蛋白的表达
再灌注24小时后，每组选取4只大鼠，安乐死、断头、摘除大脑。距缺血中心侧缘1mm处的海马和皮质区取一米大小的脑组织，置于2.5戊胺中。二醛溶液固定2小时，用PBS终止固定，再用1%锇酸溶液固定1小时，然后用PBS终止固定；将固定好的脑组织小片进行丙酮梯度脱水、环氧树脂梯度浸润包埋。进行超薄切片；切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，不知道实验设计的研究人员在透射显微镜下观察视野中的细胞超微结构和完整的自噬体。
同时，称取三组大鼠海马脑组织（1005）mg，采用Western blotting检测海马神经元中自噬相关蛋白的表达情况。具体操作如下： (1)首先将称重的海马脑组织置于系列化的Eppendorf微量离心管(EP)中，并加入1 ml强效RIPA裂解缓冲液、20 l蛋白酶抑制剂、10 l蛋白磷酸酶抑制剂加入，然后置于冰上进行超声裂解； (2)充分裂解后，置于IEC低温冷冻离心机中，4、12 000 r/min(离心半径84 mm)离心5分钟，取上清液； (3)使用蛋白质定量采用Bradford法，即在蛋白质中加入5loading buffer混匀，100水浴加热3分钟使蛋白质变性，然后保存置于-80冰箱中或直接进行实验操作； (4)使用聚丙烯在酰胺凝胶上对蛋白质样品进行电泳分离，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上； (5) 用5%牛白蛋白V封闭液封闭1小时，加入5%牛白蛋白V配置的一抗、-actin抗体(1:5 000)、Beclin1抗体(1:2 000)、LC3A/LC3B 抗体(1:2 000)、p-NF-B 抗体(1:1 000)、NF-B 抗体(1:2 000)，然后置于摇床上，4C 孵育过夜，漂洗5 次（ 5 分钟/次）用含0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST），并添加二抗、山羊抗兔辣根过氧化物酶免疫球蛋白IgG-HRP（1:10 000）、山羊抗小鼠IgG-HRP（1: 10 000)，然后置于摇床上，室温孵育1.5 h，最后用PBST冲洗5次(5 min/次)； (6)使用ECL超敏发光溶液和Bio-Pro凝胶成像仪进行彩色成像，并使用Bio-Rad Image LabTM XRS+凝胶图像分析管理系统对蛋白条带进行灰度值分析，计算出目的蛋白p的相对表达量-各组大鼠NF-B、Beclin1、LC3，即p-NF-B灰度值与NF-B灰度值、Beclin1灰度值及内参灰度值的比值-肌动蛋白灰度值比、LC3灰度值和LC3B灰度值比。每组重复上述操作4次（每只大鼠1次），取平均值。
1.6 统计方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量数据为（
s)，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。 P0.05被认为有统计学上的显着差异。
2 结果2.1 神经功能评分
造模24小时后，假手术组、模型组、通络清脑组大鼠神经功能评分分别为0分、（2.30.8）分、（1.60.5）分；造模24 h后三组大鼠神经功能评分比较，差异有统计学意义（F=5.34，P=0.010），表明脑缺血再灌注损伤模型制作成功。造模后24小时，模型组和通络清脑组大鼠神经功能评分均高于假手术组（q值分别为0.30和0.50，P值分别为0.001和0.001） ），而通络清脑组大鼠造模24 h后神经功能评分低于模型组（q=0.50，P=0.020），差异有统计学意义。
2.2 脑梗塞体积
造模24小时后，假手术组大鼠脑组织呈均匀的玫瑰红色，未见苍白缺血区；模型组大鼠脑组织出现苍白缺血区，通络清脑组大鼠脑组织出现明显苍白缺血区。减少（见图1）。造模24 h后，假手术组、模型组、通络清脑组大鼠脑梗塞体积比例分别为0、（25.176.12）%、（15.624.83）%。造模24小时后三组大鼠脑梗死体积比例比较，差异有统计学意义(F=4.26,P0.05);造模24小时后模型组和通络清脑组大鼠脑梗塞体积比例高于假手术组（q值分别为0.26和0.35，P值分别为0.001和0.001）通络清脑组造模后24小时脑梗塞体积比例低于模型组（q=0.40，P=0.040），差异有统计学意义。
图1 三组大鼠脑组织TTC染色结果
图1 三组大鼠脑组织TTC染色结果
2.3 海马神经元损伤
再灌注24小时后，假手术组大鼠海马神经元排列紧密，数量丰富，形态正常，胞质浅染，细胞核大而圆，无明显坏死；模型组大鼠海马缺血区神经元结构严重破坏，大量神经元丢失，细胞质伊红浓染，细胞核固缩。与模型组相比，通络清脑组大鼠海马缺血区神经元坏死范围缩小，神经元数量增多。细胞结构相对完整，核固缩减少，神经元损伤明显减轻（见图2和图3）。
图2 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元损伤情况（HE染色，100）
图2 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元损伤情况
图3 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元损伤情况（HE染色，200）
图3 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元损伤情况
2.4 海马和皮质自噬体的形成
再灌注24小时后，假手术组大鼠海马和皮质内偶见自噬体，胞浆内有少量空泡；模型组大鼠海马及皮质内可见双膜结构的自噬体，细胞胞浆内有大量空泡，胞浆稀疏；通络清脑组海马及皮层区自噬体数量减少，空泡数量较少，细胞质稀疏（见图4、图5）。
图4 再灌注24小时后三组大鼠海马自噬体形成情况
图4 再灌注24 h后三组大鼠海马自噬体（箭头所示）
图5 再灌注24小时后三组大鼠皮质区自噬体的形成情况（箭头）
图5 再灌注24 h后三组大鼠皮层自噬体（箭头所示）
2.5 海马神经元自噬相关蛋白的表达
再灌注24小时后三组大鼠海马p-NF-B、Beclin1、LC3相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.001);再灌注24小时后，模型组、通络清脑组和小鼠海马p-NF-B相对表达量（q值分别为29.29和9.01）、LC3（q值分别为29.56和11.89）模型组Beclin1相对表达量(q=12.38)均高于假手术组。差异有统计学意义(P<0.01),但通络清脑组与假手术组大鼠海马Beclin1相对表达量差异无统计学意义(q=2.85,P<0.05);再灌注24 h后通络清脑组大鼠海马p-NF-B(q=20.28)、Beclin1(q=9.53)、LC3(q=17.67)相对表达量低于对照组与模型组比较，差异有统计学意义(P0.01,见表1、图6)。
图6 三组大鼠海马自噬相关蛋白电泳图谱
图6 三组大鼠海马自噬相关蛋白电泳图
表1 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元自噬相关蛋白相对表达量比较(
s)
表1 再灌注24 h后三组大鼠海马神经元自噬相关蛋白表达比较
3 讨论
根据中医理论，缺血性中风属于“中风”范畴，主要是“痰瘀互结”所致[7]：“痰瘀”互化、盛衰，津液不凝则生痰浊，日久积聚。当血液进入静脉时，就会出现充血现象。痰瘀会阻塞脉络，产生瘀热。津液、血液过热，就会出现浑浊。浊滞则生痰。痰堵窍门，堵塞脉络，导致气血上冲脑部，引发“中风”。因此，治疗“中风”应以活血化瘀为主，以疏通血管、散瘀为主；辅以清热利湿药物，以清体内积热，疏通水道，祛湿热痰。三七具有活血化瘀、养血止痛的功效。黄芩具有清热利湿、凉血解毒的功效。栀子具有清热利湿、泻火除烦的功效。三者合用，可用于中风患者祛痰化瘀。热滞等；通络清脑注射粉的主要活性成分为三七总皂苷、黄芩苷、栀子苷，分别来源于三七、黄芩、栀子。现代药理表明，通络清脑注射粉具有改善血液循环、抑制血栓形成、减轻神经元损伤等作用。其中，三七总皂苷不仅可以改善血瘀大鼠的血液流变指标[8]、降低神经元损伤的风险等，Ca2+超载[9]还可以修复阿尔茨海默病大鼠受损的神经元[10] ];黄芩苷可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡，减轻氧化应激造成的损伤。 [11]、清除自由基[12]；栀子苷可抑制血小板聚集[13]。
及时恢复缺血脑组织的血液供应是目前临床治疗缺血性脑卒中的主要方法。然而，恢复缺血半暗带的血流供应，会加重缺血脑组织的神经元损伤，增加细胞凋亡，导致脑缺血。血液再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中患者重要的病理生理过程，也是影响缺血性脑卒中患者预后不可忽视的问题之一[14]。本研究结果显示，造模24 h 后，假手术组大鼠脑组织未见苍白缺血区，再灌注24 h 后海马神经元未见明显坏死，而脑组织造模24小时后模型组大鼠的脑组织可见，再灌注24小时后海马缺血区苍白缺血区损伤严重，大量神经元丢失。但造模24小时后，通络清脑组大鼠脑组织苍白缺血区域明显缩小并重新灌注。灌注24小时后，海马缺血区神经元坏死范围明显缩小，神经元损伤明显减轻。同时，造模后24小时模型组和通络清脑组大鼠的神经功能评分和脑梗死体积比均相同。高于假手术组，而通络清脑组造模后24小时大鼠神经功能评分及脑梗死体积比低于模型组，提示通络清脑注射粉可有效改善脑缺血-再灌注损伤改善大鼠的神经功能，减轻脑梗塞程度、神经元损伤，减少自噬体的形成和神经元凋亡，具有一定的脑保护作用。
自噬是指自噬性溶酶体吞噬并降解细胞内异物、受损或老化细胞器的过程，在维持细胞稳态中发挥重要作用。正常情况下，自噬处于较低水平。在缺血、缺氧、营养缺乏和氧化应激等条件下，自噬水平显着增加，以清除自由基、受损细胞器和未折叠蛋白质。然而，自噬神经元凋亡的过度激活可以引发神经元凋亡，这是由半胱天冬酶介导的程序性细胞死亡[15]。最近的研究表明自噬参与脑缺血的病理生理过程[16]。本研究结果显示，再灌注24小时后，假手术组大鼠海马和皮质中偶见自噬体，而在大鼠海马和皮质中可见双层膜结构的自噬体。模型组中，但通络清脑组大鼠海马和皮质中自噬体数量较模型组减少，提示正常大鼠脑组织中存在自噬。脑缺血再灌注损伤会激活大鼠神经元的自噬，促进其神经元功能。通络清脑散注射液可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠神经元自噬的过度激活，减少神经元凋亡。
自噬相关蛋白是在自噬相关基因（ATG）控制下转录合成的一组蛋白质，参与自噬体形成到降解的整个过程。它们的主要功能是调节自噬过程。 ATG首先在酵母中发现，迄今为止在哺乳动物细胞中已发现11个ATG同源基因，其中ATG6被命名为Beclin1，ATG8被命名为LC3[17]。 Beclin1是第一个被发现参与哺乳动物细胞自噬的关键因子。后来发现它还参与自噬体膜的形成，对自噬具有正向调节作用。研究表明，脑缺血再灌注损伤的大鼠神经元中Beclin1 的表达显着上调，能够激活自噬并诱导细胞凋亡[18]。 LC3主要以两种形式存在：LC3A和LC3B。正常情况下，细胞内LC3以细胞质不溶性LC3A的形式存在。自噬过程中，LC3A与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3B，参与自噬体膜的形成，且LC3B含量与自噬体的数量成正比，因此，LC3B含量在一定程度上可以反映细胞自噬的程度。程度[19]。既往研究表明脑缺血再灌注损伤大鼠神经元自噬增强，缺血区脑组织中LC3B的表达显着上调，并在缺血再灌注24小时达到峰值[20,21] 。目前，Beclin1和LC3B被认为是自噬的特异性标志物[22]，其表达水平可以反映自噬的水平。 NF-B是一类蛋白质，可以通过与细胞中特定的核苷酸序列结合来启动基因转录和表达。缺血、缺氧刺激会导致游离的NF-B进入细胞核，参与自噬的调节。这反过来又上调Beclin1 和LC3 的表达并诱导自噬[23]。
研究表明，脑缺血进行缺血预处理和早期诱导神经元自噬有利于消除神经元中积累的受损蛋白，提高神经元存活率，有利于减轻脑缺血再灌注损伤[24]，但自噬是“双重”的。 “一柄剑”，其对脑缺血再灌注损伤的影响也会受到造模时间、缺血阶段、观察部位、剂量等的影响；还有研究表明，抑制脑缺血后过度的神经元自噬具有保护作用，清热药可以通过抑制神经元自噬发挥脑保护作用。它能够抑制神经元自噬，减轻脑缺血再灌注引起的神经元损伤[25,26]。本次研究结果显示：模型组、通络清脑组大鼠海马p-NF-B、LC3 相对表达量以及模型组Beclin1 相对表达量均高于假手术组。通络清脑组大鼠海马p-NF-B、LC3相对表达量-NF-B、Beclin1、LC3相对表达量低于模型组，表明神经元自噬水平大鼠脑缺血再灌注损伤加重，通络清脑注射粉能有效抑制脑缺血再灌注损伤。灌注损伤大鼠神经元过度自噬可减轻脑缺血再灌注损伤。这可能是通络清脑注射粉发挥脑保护作用的重要机制。
综上所述，通络清脑注射粉能够有效改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，减轻脑梗死程度和神经元损伤，减少自噬体的形成和神经元凋亡，抑制神经元自噬相关蛋白的表达p-NF-B、Beclin1和LC3蛋白及其发挥脑保护作用的机制可能与抑制神经元过度自噬有关。但本研究并未设置阳性对照组（自噬抑制剂组）。今后实验中可加入阳性对照组，进一步阐明通络清脑注射粉的脑保护作用与抑制神经元过度自噬的相关性。
参考文献省略
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用户评论
这个研究结果很有意思！我对通络清脑这种中药一直感兴趣，尤其是它对脑缺血再灌注损伤大鼠的效果。希望能有更多后续研究深入探讨它的机制。
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听起来很专业，不过我有点不懂自噬相关蛋白表达是什么？简单解释一下会好吗？
有10位网友表示赞同！
这个通络清脑注射粉真的能保护脑细胞吗？我很想知道它对人类的效果，因为我的爷爷最近刚好得了一些与大脑有关的病症。
有10位网友表示赞同！
我觉得研究很深入，结合自噬蛋白表达分析的结果更让人相信通络清脑确实有帮助！期待未来更多应用！
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这种研究对于脑缺血再灌注损伤的治疗很有意义！如果真的能用通络清脑注射粉改善病情的话，对患者来说就是希望了！
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我很疑惑，为什么选择大鼠作为实验对象？是不是人类和老鼠的情况不同呢？需要更多数据才能得出结论吧？
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这个研究成果很有前景啊，希望能早日应用于临床，让更多人受益！我们每个人都需要保护好自己的大脑健康。
有12位网友表示赞同！
通络清脑注射粉听起来很神奇！会不会有副作用呢？还是说只有大鼠才会出现问题？
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希望这项研究能取得更大的突破，例如能明确哪些蛋白表达的变化对治疗效果关键！
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个人觉得这种方法很有创新性，但还需要更多的临床实验来证明它的有效性和安全性才好安心使用。
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通络清脑注射粉的效果是不是能持续很长时间呢？如果短期内就失效了，那也就没有多大意义了吧？
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研究人员是如何确定“脑保护作用”的呢？具体有哪些指标来衡量？希望能看到更详细的研究方法和数据分析。
有5位网友表示赞同！
这个研究的重点是神经元自噬相关蛋白表达的影响吗？会不会对其他细胞类型也有影响呢？需要进一步探讨!
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如果通络清脑注射粉的效果在人类实验中能达到与大鼠相似的水平，那将是一个巨大的突破！我希望能早日看到更详细的人体临床试验结果。
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我觉得研究结论很有说服力，而且通络清脑注射粉的“脑保护作用”对于很多神经系统疾病患者来说都有着积极的意义。 期待未来更多关于应用在人类方面的研究！
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这种实验方法有没有什么局限性呢？例如，大鼠的生理特性是否完全与人相似呢？
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这个研究结果非常有价值，我希望可以看到后续更多的研究，深入探讨通络清脑注射粉的作用机制以及可能的临床应用！
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总而言之，这个研究报告很有启发性。它表明中药在治疗脑缺血再灌注损伤方面具有潜力，值得我们进一步探索和研究！
有17位网友表示赞同！
如果通络清脑注射粉真的能有效地保护大脑健康，那将是一件非常重要的事情！我希望可以早日应用于临床，造福更多人！
有13位网友表示赞同！